1º) CULTIVOS :
Son ambientes artificiales que contienen los elementos nutritivos y las condiciones físico- químicas que permiten el desarrollo, crecimiento, conservación y estudio de los microorganismos.
Medios de cultivo:
a.- Cultivos Comunes :
Son los que contienen un medio base (Agar – Agar) para el desarrollo de microorganismos.
b.- Cultivos Enriquecidos :
Son aquellos medios destinados a lograr un crecimiento más rápido o a lograr el desarrollo de ciertos gérmenes; por Ejemplo.
Agar – Sangre;
Agar – Chocolate;
Agar – Cerebro – Corazón ;
Caldo de Selenito; etc.
c.- Cultivos Selectivos :
Son aquellos medios que permiten el desarrollo de un determinado microorganismo, impidiendo el desarrollo de otros, por Ejemplo.
Lowestein – Jensen;
TCBS; Medios SS;
Levine;
Tayer – Martín (con bilis o con taurocolato); etc.
d.- Cultivos Diferenciales :
Son aquellos medios, como la urea, el citrato, el indol, SIM, etc., que contienen una sustancia que al combinarse con algún producto del metabolismo bacteriano producen una reacción característica (por Ej. Un cambio de color) que permitirá su identificación.
e.- Cultivo virológico :
(evidencia indirecta de crecimiento en cultivos celulares).
Los virus no tienen la capacidad de crecer en cultivos sólidos para bacterias u hongos; y como son considerados como parásitos intracelulares obligados, se necesitan para su desarrollo de células vivas.
Para reralizar el aislamiento de virus podemos utilizar :
1. Cultivos Celulares
2. Huevos Embrionados
3. Animales de Experimentación
En la actualida han cobrado importancia los Métodos rápidos de Diagnóstico por
- Microscopía Electrónica,
- Técnicas Inmunológicas
- y Moleculares.
Procedimiento para el cultivo :
1.- Realizar la siembra del microorganismo (contenido en la muestra) en un medio de cultivo apropiado.
2.- Incubar para generar un crecimiento visible.
Es necesario que el médico solicitante conozca cuales son los períodos razonables para realizar las diversas clases de cultivos y que el laboratorio establezca un sistema para informar resultados preliminares.
En Bacteriología Clínica
Se requiere de un período de incubación mínimo de entre 48 – 72 HS a una temperatura de entre 35º C y 37º C.
En Virología Clínica
Se requiere aproximadamente entre 30 – 45 días de incubación
En Micología clínica
Se requiere aproximadamente de entre 7 – 15 días de incubación; empleándose universalmente como medio de cultivo el Agar – Saboureaud; al que se le puede adicionar ATB (para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes) o Cicloheximida (para inhibir el desarrollo de hongos contaminantes).
3.- Si se observa el crecimiento de colonias se realiza una nuevamente una coloración de Gram (ésta se diferencia de la primera tinción de Gram por que no visualizaremos ni hematíes ni Leucocitos, sólo observaremos lo que se desarrolló tras la incubación del cultivo).
4.- Realizar el Recuento de Colonias (expresando en UFC / ml) y observar las características de la colonia. El recuento de colonias generalmente es un recurso que se utiliza mayormente en muestras de orina (2da. Porción) en infecciones urinarias; lavado bronquial en infecciones del TRI y en muestras de catéteres.
·
IDENTIFICACIÓN DE GERMEN :
Bacterias y hongos pueden ser identificados, tras su aislamiento en cultivos sólidos son identificados por :
A.- Las características Macroscópicas de la Colonia.
B.- Pruebas Bioquímicas Específicas para cada género microbiano; por Ej. Para los Hongos se pueden realizar :
1- Auxograma = Estudia el poder de Asimilación
2- Zimograma = Estudia el poder Fermentativo
·
ANTIBIOGRAMA :
Sirve para registrar la susceptibilidad de un determinado germen a los ATB. Se define como el conjunto de procedimientos que permiten determinar la sensibilidad in vitro de un microorganismo frente a un determinado ATB.
· METODOS DIRECTOS RAPIDOS :
A.- TÉCNICAS DE INMUNOMARCADO :
Conjunto de técnicas utilizadas para la detección de antígenos del germen.
Puede realizarse a partir de las muestras donde se eliminan los antígenos como por Ej. las tomadas del foco de infección (es la muestra que ofrece mayor rendimiento), del suero, del LCR o de la orina (esta última es una muestra alternativa dada la facilidad de obtención y la posibilidad de su concentración). Las técnicas más utilizadas son :
- Inmunofluorescencia Directa (IFD)
Consiste en la unión de un Anticuerpo marcado con Isotiocinato de fluoresceína a su Antígeno correspondiente, y la posterior detección mediante microscopía de fluorescencia.
Las principales ventajas de esta técnica son su sencillez, rapidez y la posibilidad de efectuar un diagnóstico etiológico en pacientes previamente tratados con ATB.
En el Diagnóstico. En líneas generales esta técnica se aplica en detección de :
- Streptococo Pyogenes,
- Haemophilus Influenzae,
- Chlamydia Trachomatis,
- Pneumocystis Carinii,
- Cryptosporidium, etc.
· Enzimoinmunoanálisis (EIA) = Es ampliamente utilizadaen el Diagnóstico virológico por ejemplo:
- Antígeno p24 del HIV;
- Antigeno del VSR,
- Antigeno del Rotavirus,etc.
También resulta útil en el diagnóstico de otras enfermedades infecciosas causadas por:
- Chlamydia Trachomatis,
- Streptococo Pyogenes,
- Neisseria Gonorhoeae,
- Cryptococcus Neoformans,
- Cryptosporidium, etc.
· Aglutinación en Látex (AL)
Algunas de estas Pruebas resultan útiles en el diagnóstico de Meningitis Bacteriana en niños parcialmente tratados o en aquellos donde la respuesta inflamatoria y diversos índices bioquímicos del LCR no permiten diferenciar claramente entre una Meningitis Bacteriana y una Viral.
Sin embargo su uso cuantitativo es limitado en la identificación de Agentes Etiológicos.
Actualmente la AL tiene un empleo importante en muestras como LCR y Suero, donde se la utiliza para la detección de antígenos fúngicos del Cryptococcus Neoformans (hongo responsable de meningitis).
Dicha Prueba tiene una sensibilidad mayor a la dela Tinta China en LCR; mientras que su especificidad se ve disminuida ante la presencia de factor reumatoideo u otras proteínas de interferencia que inducen resultados de falsos positivos, los cuales pueden eliminarse tratando las muestras con una proteasa.
También hay pruebas de AL diseñadas para los Streptococos del Grupo A, las cuales, si bien son muy específicas son relativamente Sensibles, de manera que las pruebas que resultaren negativas deben ser respaldadas por un cultivo. Actualmente, en los inmunodeprimidos, tiene mucha importancia en la búsqueda de Antígenos Fúngicos la prueba de Aglutinación de Partículas de Látex (APL)
· Coaglutinación
También estas Pruebas resultan útiles en el diagnóstico de Meningitis Bacteriana en niños parcialmente tratados o en aquellos donde la respuesta inflamatoria y diversos índices bioquímicos del LCR no permiten diferenciar claramente entre una Meningitis Bacteriana y una Viral.
· Contrainmunoelectroforésis (CIE)
· Inmunoperoxidasa
B.- TÉCNICAS MOLECULARES :
Son un conjunto de técnicas que hoy en día posibilitan la Detección del Genoma de un determinado microorganismo, aunque la cantidad de inóculo en la muestra sea muy bajo.
Estas Técnicas Comprenden :
· Hibridación con Sondas de Ac. Nucléico
Estas sondas genéticas consisten en una molécula de Ac Nucleico monocatenario y marcado con un isótopo radiactivo (Ej. 32 P) que, tras hibiridarse (unirse) a una secuencia complementaria de ADN, permite su detección .
Empleando sondas específicas podemos detectar el agente etiológico presente en una muestra, sin necesidad de realizar un cultivo de la misma.
También la construcción de sondas genéticas para ciertos factores de virulencia (toxinas), posibilita detectar a los microorganismos que transporten los genes que los codifican; por Ej. tanto la Hibridación con Sondas para la Enterotoxina de la Escherichia Coli como la Hibridación con Sondas para la Toxina Colérica del Vibrio Cholerae pueden ser aplicadas directamente en las heces para luego detectar el agente patógeno respectivo.
Esta Técnica también se emplea para detectar el genoma de:
- Chlamydia Trachomatis,
- Neisseria Gonorrhoeae,
- Streptococo Pyogenes,
- Histoplasma Capsulatum, etc.
· Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR)
Cuando conocemos la secuencia de nucleótidos, o parte de ella, de un determinado gen; podemos añadir secuencias de nucleótidos conocidos (cebadores) apropiados para la muestra lo que permitirá que una ADN polimerasa genere gran cantidad de copias del gen estudiado, las cuales serán fácilmente identificables con una electroforésis.
La PCR tiene una gran sensibilidad por lo cual los laboratorios clínicos están accediendo cada vez más a su uso, tan es así que la PCR está reemplazando al cultivo para la detección rápida del HIV; y ya se anticipan muchas otras aplicaciones como la detección de microorganismos no cultivables, de crecimiento lento o de difícil cultivo. Sin embargo se trata de una técnica compleja que requiere de cuidados extremos para evitar contaminaciones que lleven a resultados de falsos positivos.
POR METODOS INDIRECTOS :
Son métodos que permiten detectar las huellas que el germen dejó tras su contacto con el sistema inmunológico del huésped (anticuerpos circulantes y/o células sensibilizadas contra determinado microorganismo).
Comprende Pruebas Serológicas y Pruebas de Hipersensibilidad Retardada o Celular.
· SEROLOGIA :
Son método que permite determinar niveles de Anticuerpos en el suero del paciente.
En el desarrollo de estas técnicas es conveniente extraer 2 muestras de suero (una en el período agudo de la enfermedad y otra en el período de convalecencia) para comparar los niveles de anticuerpos dosados en cada período; estos sueros obtenidos (muestras) en cada período y luego comparados se denominan como muestras pareadas.
Los resultados se expresan cuantitativamente, denominándose Titulo a la mayor dilución del suero del paciente en la cual aún se puede detectar los anticuerpos contra un germen determinado.
Se considera que hay infección reciente cuando se registra un aumento del Título de Anticuerpos en 2 o más diluciones de suero (Ej. de 1/16 a 1/64); entonces consideramos que hay una infección resiente
Decimos que se produjo una seroconversión cuando los niveles de Anticuerpos superen 4 veces los valores del Título.
Excepto en el caso de dosaje de IgM, en donde se recomienda extraer una sola muestra de suero en casos particulares de infección reciente (por Ej. Influenza tipo b, etc) . Si el agente infeccioso es poco frecuente (viris de la Rabia, HIV o Toxina Botulínica), la presencia de Anticuerpos específicos en una sola muestra permite establecer el diagnóstico.
Dentro de las técnicas más utilizadas en la detección de Anticuerpos citamos :
1.- Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) =
2.- Fijación del Complemento (FC) =
3.- ELISA =
4.- EIA =
5.- Contrainmunoelectroforesis (CIE) =
6.- Inmunodifusión en Gel de Agar (IDGA) =
7.- Inmunomicroscopía Electrónica Empleadas para virus
8.- Inhibición de la Hemaglutinación
REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD RETARDADA :
Son reacciones intradérmicas como la (PPD, tricofitina, candidina, histoplasmina, coccidioidina, paracoccidioidina, Aspergilina, etc.) donde se efectúa una inoculación intradérmica no letal con antígenos de cierto microorganismo para tras 24 – 48 Hs poner en evidencia la sensibilidad del huésped frente a ese microorganismo.
Una prueba cutánea positiva en un individuo sano indica contacto previo con el microorganismo, y adquiere gran utilidad en los estudios.
--------------------------------------------------------------------------------
Laboratorio de Análisis Clínicos en Huelva
Hematología, Bioquímica, Estudios de coagulación, Estudios de orina y microbiología, Marcadores tumorales, Serologías, Fármacos, Autoinmunidad, Estudio de vitaminas, Análisis de sangre.
